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Quando il potere magico della tavola di Ahkmenrah comincia a morire, Larry deve intervenire per salvare la magia ed i suoi amici prima che sia troppo tardi, e così, i protagonisti di Una notte al museo attraversano l’Atlantico e da New York sbarcano a Londra, al British Museum.

Larry Daley è disoccupato e divorziato e rischia di perdere la custodia congiunta del figlio se non troverà un lavoro. Accetta quindi di fare il guardiano notturno al New York Museum of Natural History. Quello che non sa, ma che ben presto scoprirà, è che nel museo di notte animali e statue si animano creando un grande caos.

Sono passati due anni e Larry Dailey (Ben Stiller) ha lasciato il museo di Storia Naturale, dove lavorava come guardiano notturno, ed è entrato nel mondo degli affari diventando un importante imprenditore. Durante una visita al museo scopre che tutte le ricostruzioni, tranne alcune più popolari quali Teddy Roosevelt (Robin Williams), Rexy lo scheletro del T-rex e la tavola d'oro del faraone Ahkmenrah, saranno sostituiti con degli ologrammi. In seguito Larry riceverà una allarmante richiesta di aiuto da parte di Jedediah (Owen Wilson) il quale, insieme alle altre figure del vecchio museo, sta resistendo contro il fratello maggiore del faraone incontrato nel primo episodio che si è risvegliato, insieme a tutti i personaggi trasferiti e all'intero museo "più grande del mondo" grazie ad uno scherzo di una simpatica scimmietta cappuccina..